Исследователи используют иммуноанализы для выявления присутствия целевых антигенов и количественного определения концентрации антигена для экспериментального использования. Эти анализы должны быть точными, чтобы вселить уверенность в собранные данные. Ассоциированные антитела должны демонстрировать высокую специфичность связывания и аффинность, чтобы гарантировать точность результатов и минимизировать перекрестную реактивность. Несмотря на широкое использование антител в исследованиях, диагностике и клинических тестах, не существует стандартных рекомендаций по валидации антител перед их внедрением в приложение.
К сожалению, некоторые коммерчески производимые антитела не прошли надлежащую валидацию. Без надлежащей валидации исследователи могут получать противоречивые результаты и генерировать искаженные данные, подверженные неправильной интерпретации. По этой причине важно, чтобы исследователи знали о неотъемлемых рисках, связанных с использованием наборов от непроверенных компаний.
Как валидируются антитела в иммунологических анализах?
Валидация антител в иммунологическом анализе выполняется посредством многопараметрического анализа специфичности связывания, специфичности связывания в приложении, аффинности связывания и воспроизводимости.
- Специфичность привязки
Специфичность связывания относится к способности антитела различать антигены и связываться с антигеном-мишенью, игнорируя другие. Антитело может быть чувствительным к интересующему белку, но при этом вступать в перекрестную реакцию с другими белками, присутствующими в образце. Во-первых, важно понять, какой тип иммуногенов использовался для создания антител и как структурированы целевые белки в образце. Например, антитела, полученные против синтетических пептидов, могут не связываться с нативными белками, в то время как антитела, полученные против очищенных белков, могут не связываться при денатурации.
Специфичность связывания может быть определена путем правильного использования контролей. Валидация только с положительными контролями не гарантирует надежности связывания, поскольку несколько белков могут иметь сходные эпитопы, или антитело может иметь несколько эпитопов. Использование близкородственных белков в качестве отрицательного контроля может быть полезным, но поликлональные антитела склонны к смещению связывания эпитопов между партиями. Таким образом, ни положительный, ни отрицательный контроль сами по себе недостаточны, и их необходимо использовать вместе. Лучшим типом положительного контроля являются неэкспрессирующие клетки, трансфицированные интересующим белком. Лучшим типом отрицательного контроля являются нокаутированные клетки, которые не экспрессируют интересующие белки.
- Специфика привязки к приложению
После доказательства высокоспецифичности антител следующим шагом является обеспечение их специфичности при использовании по назначению. Разные платформы для иммуноанализа имеют разную структуру поверхности, поэтому выбранная платформа может повлиять на результаты анализа. Некоторые коммерческие анализы демонстрируют высокую специфичность связывания для одного типа применения, но не для других.
Иммунопреципитация позволяет исследователям выделять белковый антиген из раствора с помощью антитела, которое связывается с белком. Между тем масс-спектрометрия (МС) — это высокочувствительный метод идентификации и количественного определения белков в больших образцах, особенно антител на основе аминокислотных модификаций.
В настоящее время существует два метода оценки антител на основе РС. Первый включает оценку качества IP-антител путем повышения уровня антител против других белков и использования MS в полученных осадках для количественного определения антител, которые уничтожают свои мишени. Второй метод включает использование хроматографии с исключением размера для фракционирования клеточных белков, их биотинилирования и иммунопреципитации, при этом каждый тип коррелирует с разным цветом гранул, затем гранулы прогоняют в проточном цитометре для идентификации антитела по цвету и количеству белка, связанного сигналом стрептавидина.
- Близость к привязке
Аффинность связывания относится к силе, с которой антитело связывается с эпитопом-мишенью. Можно с высокой точностью определять сродство к связыванию моноклональных антител, поскольку эти антитела гомогенны и селективны по отношению к одному отдельному изотопу. Однако для поликлональных антител может быть получено только среднее сродство из-за смеси присутствующих антител. Существует несколько методов определения сродства к антителам, включая методы на основе ELISA, микромасштабный термофорез (MST) и поверхностный плазмонный резонанс (SPR).
- Методы, основанные на ELISA, являются наиболее популярными и включают инкубацию концентрации антител с антигеном в растворе до тех пор, пока она не достигнет постоянной стадии. Наборы ELISA позволяют исследователям измерять концентрацию несвязавшихся антител.
- MST измеряет движение молекул вдоль микроскопических градиентов температуры с помощью инфракрасного лазера и флуоресценции. При нацеливании ИК-лазера связывание молекул приводит к изменению перемещения поперек градиента.
- SPR обнаруживает молекулярные взаимодействия с помощью оптического детектора. В этом методе свет от поверхности с металлическим покрытием отражается между антителом, иммобилизованным в стеклянной призме, и антигеном в растворе, а затем исследователи анализируют, как изменяется угол отражения, чтобы определить, произошло ли связывание.
- Воспроизводимость антител
Использование одного и того же антитела в разных партиях должно дать схожие результаты. Воспроизводимость жизненно важна для всех приложений, но исследователи обнаружили, что при использовании готовых наборов для иммунологического анализа заказ нескольких наборов антител у одной и той же компании не всегда приводит к одинаковым результатам. Это особенно актуально для поликлональных антител, поскольку поставщики часто используют один и тот же номер по каталогу для классификации разных антител.
Выбирайте проверенные комплекты от надежной компании
Разработка и валидация иммунологических анализов собственными силами зависит от множества факторов, что делает этот процесс дорогостоящим, сложным и отнимающим много времени. Коммерческие, готовые иммунологические анализы могут быть менее трудоемкими и более рентабельными для исследователей. Однако продукты среднего производителя имеют разную степень проверки и могут не обеспечивать одинаковых результатов в нескольких приложениях.
В конечном счете, лучшим решением для многих исследователей является сотрудничество с опытной и надежной компанией, которая предлагает возможность настраивать свои наборы, используя существующие реагенты или разрабатывая новые. Эти компании позволяют исследователям обеспечить полную валидацию анализа, сохранить контроль над результатами анализа и соответствовать квалификационным требованиям, сокращая при этом время разработки.